ClearSee™ 是一款植物透明化試劑，僅需固定、洗凈、透明化3步操作即可輕松實現(xiàn)植物組織的透明化。本方法由名古屋大學研究生院的栗原大輔博士等人開發(fā)。
作為植物科學的研究工具，ClearSee™ 有望用于闡明細胞水平的現(xiàn)象與生物個體之間的系統(tǒng)聯(lián)系。
<資料提供>
名古屋大學研究生院 理學研究科
特聘助教栗原大輔、先驅(qū)研究員水多陽子
◆特點
● 植物用透明化試劑
● 無需制備切片，即可熒光觀察植物內(nèi)部的整體結(jié)構(gòu)
● 操作僅需3步：①固定、②清洗、③透明化
◆可透明化的組織
植物
◆透明化所需時間
根莖：1~2日、葉和幼苗：4~7日、雌蕊：2周、成熟組織：4周
※ 上述時間僅供參考。透明化所需的時間因植物種類以及組織不同有所差異。
◆透明化所需的試劑
▼試劑
1. ClearSee™
2. 純凈水
3. 多聚甲醛 (產(chǎn)品編號：160-16061)
4. 2 mol/L 氫氧化鈉溶液（產(chǎn)品編號：194-05361)
5. 10 x PBS (產(chǎn)品編號：163-25265)
6. 1 x PBS (產(chǎn)品編號：164-25511)
7. 亞硫酸鈉（產(chǎn)品編號：198-03412） ※僅在使用ClearSeeAlpha時需要使用
▼儀器
|
1. 高壓滅菌鍋 2. 局部排氣設(shè)備（如通風室） 3. 真空泵 4. 干燥器 5. 60℃恒溫器 6. 錐形管 7. 微管 |
8. 封口膜 9. 針 10. 鑷子 11. 蓋玻片 12. 載玻片 13. 凡士林 14. ClearSee™透明化標本用熒光顯微鏡※和推薦物鏡※※ |
|
※共焦顯微鏡、雙光子顯微鏡 ※※請準備適配折射率 (RI=1.41)的物鏡，建議在獲取數(shù)據(jù)之前咨詢顯微鏡制造商。 |
|
ClearSeeAlpha是什么？
ClearAlpha是改良版的ClearSee™，改良方法為向ClearSee™中加入亞硫酸鈉至50mM。使用常規(guī)款ClearSee™進行透明化時，部分種類植物的葉和果實會因氧化而變成褐色，導致難以觀察，而亞硫酸鈉的還原作用可以實現(xiàn)清晰的觀察。
請根據(jù)需求制備ClearSeeAlpha，即配即用。
◆Protocol
Protocol（視頻）
請查看以下文獻：
Kurihara, D. et al., : J. Vis. Exp., e63428, 179(2022).
doi:10.3791/63428
◆應(yīng)用示例
擬南芥（葉/根）的觀察示例
圖1. 透明化的擬南芥葉
明亮視野中組織呈透明狀，葉綠素的紅色自發(fā)熒光消失。由于可以觀察完整的葉片，因此也可以觀察到內(nèi)部維管束中的熒光蛋白。
圖2. 使用ClearSee™處理4日的擬南芥根1）
生長素應(yīng)答細胞的細胞核用綠色顯示，全身細胞的細胞核用紫色顯示。
*由Kurihara, D. et al., : Development, 142(3), 4168-4179 (2015)改編并轉(zhuǎn)載。
雌蕊的熒光觀察示例
圖3. 觀察完整透明化后的雌蕊2）
花粉管上使用4種熒光蛋白（藍色、綠色、黃色和紅色）分別進行標記。
*由Kurihara, D. et al., : Development, 142(3), 4168-4179 (2015)改編并轉(zhuǎn)載。
其他植物
圖4. 透明化的植物葉片
使用ClearSee™處理6天的藍豬耳、矮牽牛、煙草、番茄、黃瓜、水稻※的葉片。
※ 對水稻進行透明化處理時，由于水稻葉片表面存在蠟質(zhì)層，溶液難以滲透到組織中。因此在固定操作之前，請將葉片浸泡在氯仿等有機溶劑中10~30 s，以去除蠟質(zhì)。
子房和角果的觀察示例
圖5. 左：ClearSee™、中：ClearSee改良方法（＋50mM 2-氨基乙硫醇鹽酸鹽）、右：ClearSeeAlpha（＋50mM 亞硫酸鈉
通過向ClearSee™中加入50 mM亞硫酸鈉（即“ClearSeeAlpha”法），可抑制氧化導致的褐色色素沉著。
*由Kurihara, D. et al., : Plant Cell Physiol., 62(8), 1302-1310 (2021)改變并轉(zhuǎn)載
擬南芥（種子）的觀察示例
對授粉5天后的擬南芥種子進行透明化處理，并用香草醛染色單寧。
使用ClearSeeAlpha法的種子在15天后可確認到氧化單寧的去除效果，可對透明化的種子進行觀察。