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蛋白質(zhì)芯片是一種高通量的蛋白質(zhì)免疫檢測分析技術(shù)，可以簡單的理解為多重ELISA檢測技術(shù)。但是不同于ELISA的是，它一次試驗(yàn)可以檢測幾百種目標(biāo)因子，且只需10-100ul的樣品。抗體芯片是蛋白質(zhì)芯片中的主要類型，抗體芯片是將多種不同的捕獲抗體印制在固相支持物上，每種抗體孤立成點(diǎn)，抗體之間不相互影響，呈方陣排列。最終得到芯片結(jié)果圖片，通過軟件提取圖片熒光值或灰度值，得到芯片數(shù)據(jù)，根據(jù)數(shù)據(jù)來比較目標(biāo)因子信號(hào)差異和定量檢測目標(biāo)因子含量。
蛋白質(zhì)芯片的原理
蛋白質(zhì)芯片的檢測原理主要是基于抗原抗體特異性非共價(jià)結(jié)合。蛋白質(zhì)芯片目前采用的檢測方法主要有雙抗體夾心法檢測和樣品標(biāo)記法檢測。
夾心法抗體芯片是將捕獲抗體預(yù)先固定在固相載體上，生物樣品加入到芯片上一起孵育反應(yīng)后， 其特異性的抗原與捕獲抗體結(jié)合，然后加入生物素標(biāo)記的檢測抗體一起孵育，最后通過HRP-鏈霉親和素與化學(xué)發(fā)光底物、或者熒光染色劑-鏈霉親和素結(jié)合作為信號(hào)檢測?；?ldquo;三明治”雙抗體夾心法建立的芯片，高品質(zhì)的抗體對(duì)是此方法的關(guān)鍵，夾心法有很高的靈敏度，檢測濃度可以低至1-10 pg/mL;每增加檢測一個(gè)蛋白，芯片上就需要增加一個(gè)抗體對(duì)， 這樣可能出現(xiàn)交叉反應(yīng)，因此需要將每個(gè)抗體對(duì)與芯片上其他抗體對(duì)進(jìn)行檢測，驗(yàn)證是否可以引入這個(gè)抗體對(duì)，且不對(duì)其他抗體對(duì)檢測造成干擾，通過優(yōu)化篩選將交叉反應(yīng)降到最小。
蛋白質(zhì)芯片的優(yōu)勢
1.樣品處理簡單：可以直接用粗生物樣品（血清、血漿、尿、體液等）進(jìn)行分析，只需經(jīng)過離心處理即可；
2.樣品用量少：可以低至10μl-100μl樣品檢測；
3.高通量：一個(gè)樣品一次試驗(yàn)可以檢測多種因子(高達(dá)成百上千種)，同時(shí)快速的發(fā)現(xiàn)多個(gè)生物標(biāo)記物，且?guī)滋炜梢酝瓿缮锨€(gè)樣品的檢測；
4.特異性和靈敏度高：單克隆抗體芯片特異性高，可鑒定未知抗原/蛋白質(zhì)，以減少測定蛋白質(zhì)序列的工作量，且蛋白芯片的靈敏度高可以發(fā)現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì)及生物標(biāo)志物；
5.可以測定疏水蛋白質(zhì)：與“雙相電泳加質(zhì)譜”相比，除了有相似功能外，并可增加測定疏水蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能；
6.集成性：在同一系統(tǒng)中集發(fā)現(xiàn)和檢測為一體；
7.可定量檢測：結(jié)合至芯片上的抗體通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來對(duì)測定抗原進(jìn)行定量，但一般飛行質(zhì)譜不用于定量分析；
8.替代和互補(bǔ)傳統(tǒng)檢測方法：利用抗體芯片, 可替代 Western Blot；利用定量抗體芯片，可替代ELISA定量檢測；抗體芯片可以互補(bǔ)流式細(xì)胞儀不足的功能，如將細(xì)胞溶解，可測定細(xì)胞內(nèi)的抗原，而且靈敏度遠(yuǎn)高于流式細(xì)胞儀；
9.性價(jià)比高：利用定量芯片一次性檢測大量目標(biāo)因子，平均定量每個(gè)因子所需的價(jià)錢遠(yuǎn)比ELISA便宜。
蛋白質(zhì)芯片的分類
根據(jù)原理：夾心法芯片、標(biāo)記法芯片、競爭法芯片
根據(jù)載體：玻片芯片、膜芯片、96孔板芯片
根據(jù)性能：定量芯片和半定量芯片
根據(jù)種屬：人類抗體芯片、小鼠抗體芯片、大鼠抗體芯片、豬抗體芯片、猴抗體芯片
根據(jù)檢測目標(biāo)：細(xì)胞因子（Cytokine) ；抗體芯片凋亡因子（Apoptosis）；抗體芯片肥胖因子（Adipokine)；抗體芯片?血管生成因子（Angiogenesis）；抗體芯片炎癥因子（Inflammation）；抗體芯片動(dòng)脈粥樣硬化抗體芯片（Atherosclerosis）；趨化因子（Chemokine)；生長因子（Growth factor）抗體芯片；基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase)抗體芯片；白介素（Interleukin)抗體芯片；磷酸化（Phosphorylation）抗體芯片；急性腎損傷(Acute Kidney Injury)抗體芯片
適用于樣品類型
血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液、組織裂解液；
除了這些常見的樣品，全世界客戶使用RayBiotech抗體芯片產(chǎn)品檢測成功的特殊樣品還有尿液、眼淚、唾液、痰、腦脊液、前列腺液、腹腔注射液、奶水、初乳、支氣管肺泡灌洗液、膿腫液、中耳液、血小板釋放物、骨頭裂解液等。
樣品的收集方法
血清：收集全血至普通離心管或者采血管（BD vacutainer公司的紅頭真空采血管，不含抗凝劑、防腐劑或者分離劑）,4℃放置30-45min, 以3000-5000rpm/min離心10min, 取上清檢測或者凍存（-20或-80℃）。
血漿:收集全血至BD vacutainer公司的EDTAK2、肝素鋰、或者枸櫞酸鈉等真空采血管，以3000-5000rpm/min離心10min, 取上清檢測或者凍存（-20或-80℃）。
尿液：收集不添加穩(wěn)定劑的尿液樣本，高速離心樣本(如：10000 rpm離心 5min 或5000 rpm離心10 min)，取上清分裝，利用干冰或甲醇浴使樣本迅速結(jié)凍，儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆谩?/span>
細(xì)胞上清（條件培養(yǎng)基）：血清中含有部分細(xì)胞因子，所以最好制備無血清或低血清條件培養(yǎng)基。在第0天,于100mm培養(yǎng)皿中加入完全培養(yǎng)基，然后接種1X106個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)第3天，倒掉培養(yǎng)基，加入6-8ml低血清培養(yǎng)基(如含有0.2%牛血清的培養(yǎng)基)；第5天，收集低血清的培養(yǎng)基于15ml離心管中，2000rpm、4℃離心10min，收集上清，分裝于1.5ml EP管中，儲(chǔ)存于-80℃中，可以保存1年以上。不同細(xì)胞可根據(jù)生長狀況確定培養(yǎng)時(shí)間。
Q&A
1.半定量和定量芯片的差異？
1）檢測原理和載體的不同：半定量芯片目前有夾心法和標(biāo)記法半定量芯片，且載體有膜的和玻片的。
定量芯片目前只是采用夾心法，且載體只有玻片。
2）抗體陣列的數(shù)量：定量芯片底部沒有barcode(即白色的條碼),且16個(gè)孔每個(gè)孔都點(diǎn)有抗體陣列，而半定量芯片一般都是上半部分8個(gè)孔點(diǎn)有抗體。
3）抗體重復(fù)點(diǎn)：定量芯片每個(gè)點(diǎn)都是4個(gè)重復(fù)點(diǎn)，半定量芯片是2個(gè)重復(fù)點(diǎn)。
4）檢測性能的差異。
2.膜芯片都有哪些方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行拍照？
1）化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照；2）膠片曝光成像；3）比色法成像；4）紅外掃描法成像
3.玻片芯片都有哪些儀器可以掃描結(jié)果？
一般來說，大多數(shù)基因芯片掃描儀都可以使用，只要具有一個(gè)Cy3標(biāo)記（綠色）通道和≤20μm的像素分辨率，并能夠掃描標(biāo)準(zhǔn)大小的玻片即可。
4.定量芯片試劑盒中玻片的數(shù)量，規(guī)格，可以檢測幾個(gè)樣品？
一般定量芯片試劑盒的規(guī)格有1張，2張，4張玻片的規(guī)格；1張玻片上可以做8個(gè)孔的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其余8孔可以檢測樣品；對(duì)于2張玻片，可以每張玻片都做標(biāo)準(zhǔn)曲線，這樣2張玻片就可以檢測16個(gè)樣品；或者2張玻片同時(shí)操作，保持所有條件一致，可以在第一張玻片上只做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，從第二張玻片上每張玻片上做一個(gè)空白control和一個(gè)陽性質(zhì)控(可選用standard3)其余孔可以用于檢測樣品。
操作步驟
已發(fā)表文獻(xiàn)